Ablaufschema für den Nachweis von Sars-CoV-2 aus Abwasserproben

Einführung

Covid-19 Infizierte scheiden SARS-CoV-2 Viruspartikel oder deren Fragmente auch mit dem Stuhl aus. Dadurch gelangen Virusfragmente in die Kanalisation, wo sie mit weiteren häuslichen und anderen Abwässern vermischt und dadurch verdünnt werden. Abbau- und Zerfallsprozesse vermindern die Anzahl an messbaren Virusfragmenten weiter. Aus einer 24h Tagesmischprobe im Zulauf einer Kläranlage wird das Genom des SARS-CoV-2 Virus isoliert und bestimmt. Für den Nachweis von SARS-CoV-2 wird der weithin bekannte PCR-Test herangezogen, wie er auch bei der Testung von Humanproben zum Einsatz kommt. Dabei wird das Erbgut des Virus, also sein genetisches Material (RNA) nachgewiesen, das zuerst aus den Proben aufkonzentriert werden muss. Nach dem quantitativem Nachweis werden die Daten auf Einwohnerzahlen hochgerechnet und es kann ein Bild des Infektionsstatus erstellt werden.

Abb. 1: Ablaufschema der Abwasseranalysen und Auswertungen


Der reine analytische Teil umfasst vier Schritte, welche in Abbildung 2 dargestellt sind und in weiterer Folge beschrieben werden:

• Probenahme und gekühlter Transport ins Labor
• Probenaufarbeitung durch Aufkonzentrierung mittels PEG-Fällung
• Extraktion und Isolation der RNA aus dem Konzentrat
• qPCR Nachweis

Nach Stand des Wissens basiert der Nachweis auf viraler RNA, während intakte Viren im Abwasser nicht zu erwarten sind.

Die Proben werden innerhalb des Coron-A Projektes in drei verschiedenen Laboren verarbeitet. Das Labor der TU Wien verarbeitet hierbei die Proben aus Wien, dem Burgenland, Niederösterreich und Oberösterreich, das Institut für Mikrobiologie der Universität Innsbruck verarbeitet die Proben aus Vorarlberg, Salzburg und Kärnten und die Gerichtsmedizin der Medizinischen Universität Innsbruck verarbeitet die Proben aus der Steiermark und Tirol. Die aktuell gemessenen Virus-Konzentrationen werden (mit Ausnahme der Tiroler Kläranlagen) in einer gemeinsamen Datenbank abgelegt und für weitere Analysen herangezogen, aufbereitet und visualisiert.

Abb. 2: Schema des analytischen Teils der Abwasseruntersuchung

1 - Probenahme und gekühlter Transport ins Labor

Zur Dokumentation ihrer Reinigungsleistung entnehmen Kläranlagen routinemäßig eine Tagesmischprobe, bei der nach jeweils einer bestimmten Menge an zugeflossenem Abwasser eine kleine Teilmenge entnommen und über 24 Stunden zu einer Tagesmischprobe vereint wird. Diese wird von den Kläranlagen zur Dokumentation der Abwasserbeschaffenheit und in weiterer Folge für den Nachweis der Reinigungsleistung chemisch analysiert. Für den Nachweis von Sars CoV 2 aus Abwasserproben wird ein Teil derselben Probe herangezogen, sodass für den Kläranlagenbetreiber kein Mehraufwand für die Probenahme entsteht.

2 - Probenaufarbeitung durch Aufkonzentrierung mittels PEG-Fällung

Für die nachfolgende Aufkonzentrierung werden zwischen 40 und 120 ml Abwasser verwendet. Abwasser ist voll von Biomasse wie Mikroben, Zellen usw. All diese Biomasse besitzt - wie SARS- CoV-2 - ebenfalls genetisches Material. Da die SARS-CoV-2-Konzentation im Abwasser sehr gering ist und das fremde Genmaterial bei der Analytik stören würde, muss für einen zielgerichteten Nachweis zuerst die nicht interessierende, überschüssige Biomasse entfernt werden. Dies erfolgt durch eine sanfte Zentrifugation, bei der der Großteil an bakteriellen Zellen und Grobpartikeln entfernt wird. Zurück bleibt ein klarer Überstand in dem die leichten Virusfragmente enthalten sind. Nach der Grobpartikelentfernung müssen die Virusfragmente aus dem klaren Überstand abtrennt werden. Weil die Virusfragmente sehr leicht (geringer Dichteunterschied zwischen Abwasser und Viruspartikel) sind, wird ein Hilfsmittel zugesetzt, das bei der Abtrennung durch Zentrifugation den Prozess unterstützt. Dafür kommt PEG zum Einsatz, weshalb der Prozess auch als PEG-Fällung bezeichnet wird. PEG steht für Polyethylenglycol das gemeinsam mit Kochsalz dem klaren Überstand zugegeben wird.

Nach ca. 10 15 Minuten haben sich das PEG und das Salz gelöst und in der Flüssigkeit setzt nun ein Prozess ein, der als Aussalzen bezeichnet wird. Die hohe PEG- und Salzkonzentration führen dazu, dass dem Wasser seine Eigenschaft als Trägersubstanz/Lösungsmittel für die Virenpartikel entzogen wird. Durch ein Abkühlen der Probe auf 4°C wird dieser Prozess verstärkt und als Resultat fallen die Virusfragmente und andere Bestandteile der klaren Abwasserprobe aus. Durch eine zweite, intensive Zentrifugation werden die Virusfragmente am Boden eines Gefäßes aufkonzentriert. Nach dieser zweiten Zentrifugation befinden sich die Virenpartikel in einem kaum sichtbaren Rückstand - dem sogenannte "Pellet" - und der klare Überstand wird verworfen. Das Pellet wird in einer speziellen Pufferlösung aufgenommen und steht für den nächsten Arbeitsschritt bereit. Beide Zentrifugationsschritte sind sehr zeitaufwendig und stellen das arbeitsintensive Nadelöhr bei der Probenverarbeitung dar.

3 - Extraktion und Isolation der RNA aus dem Konzentrat

Aus dem bei der Probenaufbereitung gewonnen Pellet wird das genetische Material, die RNA, extrahiert. Dies erfolgt entweder mit Hilfe von Extraktionsrobotern oder aufwendig per Hand. Als Ergebnis erhält man einen winzigen Tropfen (40-100 µl) sauberes RNA-Extrakt, welches direkt für den PCR-Nachweis eingesetzt oder für eine vollständige Sequenzierung herangezogen werden kann. Das genetische Material des SARS-CoV-2 Virus aus 40-120 ml Abwasser werden somit in 40-100 µl RNA-Extrakt ca. 1000-fach aufkonzentriert.

4 - qPCR-Nachweis

Der nachfolgend eingesetzte PCR-Test (qPCR bzw. RT qPCR steht für quantitative, also mengenmäßige Echtzeit-PCR) funktioniert ident zu denjenigen der Individualtests. Allerdings werden bei der Bestimmung im Abwasser zusätzlich Mengen-Standards (so genannte quantitative Standards) mit bekannten und definierten Mengen an genetischem Material des SARS-CoV-2 Virus mituntersucht. Dies erlaubt zusätzlich zu einem rein qualitativen Nachweis (ob das Virus vorhanden ist oder nicht), auch dessen mengenmäßige Bestimmung. Die Zahl an Virusfragmenten im RNA-Extrakt wird nach der Analyse auf die Konzentration im Abwasser zurückgerechnet. Dieser sogenannte Virustiter, manchmal auch als Viruskonzentration oder einfach als Virussignal bezeichnet, wird abschließend in Genkopien pro ml Abwasser angegeben.